jueves, 8 de marzo de 2012

EXPERIMENTO DE Meselson y Stahl



Meselson y Stahl estos dos doctores descubrieron la replicación semiconservativa del ADN mediante un experimento muy bien reconocido. Cultivaron E. coli en un medio con 15 N, isótopo pesado del Nitrógeno. Despues de varias generaciones se midió la densidad del ADN bacteriano a traves de una centrifugación en gradiente de densidad con CsCl.
El experimento de Meselson-Stahl fue un experimento realizado en 1957 por Matthew Meselson y Franklin Stahl en el que se demostró que la replicación de ADN era semiconservadora. Una replicación semiconservadora es aquella en que la cadena de dos filamentos en hélice del ADN se replica de forma tal que cada una de las dos cadenas de ADN formadas consiste en un filamento proveniente de la hélice original y un filamento nuevo sintetizado.


Meselson y Stahl (1957) diseñaron un experimento para tratar de averiguar la forma en la que se realiza la replicación del ADN en E. coli, es decir, la pregunta que se plantearon fue: ¿Qué modelo de replicación del ADN sigue E. coli, semiconservativo, conservativo o dispersivo?. Para contestar a esta pregunta, diseñaron un experimento en el que marcaban el ADN de la bacteria E. coli con Nitrógeno pesado N15, para ello hicieron crecer las bacterias durante 14 generaciones sucesivas en un medio que contenía como única fuente de Nitrógeno N15. Durante estas 14 generaciones el ADN de las bacterias las bacterias se había sintetizado con bases nitrogenadas con Nitrógeno pesado (N15).


Posteriormente, comprobaron que podían distinguir el ADN del las bacterias que crecían en un medio normal (con N14) del ADN de las bacterias que habían crecido durante 14 generaciones en N15. Para ello extrajeron el ADN de ambos tipos de bacterias y lo centrifugaron en un gradiente de densidad de CsCl. El resultado fue que la densidad del ADN de las bacterias que habían crecido en presencia de N15 era mayor que el ADN de las bacterias que habían crecido con N14. 

Una vez comprobado que eran capaces de distinguir el ADN de ambos tipos de bacterias, continuaron el experimento de la siguiente forma: Las bacterias que habían estado creciendo en Nitrógeno pesado (N15) las pasaron a un medio de cultivo que contenía N14 (Nitrógeno normal) y a distintos tiempos, media generación, una generación, dos generaciones, tres generaciones de replicación, tomaban una muestra del cultivo bacteriano, extraían el ADN y centrifugaban en gradiente de densidad de CsCl.


Observaron que solo había una marca, la que pertenecía al 15 N. posteriormente pasaron el cultivo a un medio con 14 N, Nitrógeno ligero, y después de varias generaciones realizaron de nuevo la centrifugación comprobando que existía una banda que estaba entre el 15 N y el 14 N. Con ello dedujeron que una hebra pesada hacía el papel de cadena molde con lo cual se unían nucleótidos con 14 N para formar la cadena copia, y la otra hebra pesada hacía tanto de lo mismo, por lo cual no se conserva la hélice doble en la replicación. Si no hubiera ocurrido esto se hubieran observado dos bandas, una correspondiente al 15 N y otra al 14 N. La idea de la replicación dispersiva también se refutó debido a que si se realizara este mecanismo, en el gradiente de densidad hubieran aparecido multitud de bandas correspondientes al grado de dispersión de las cadenas.


Meselson y Stahl (1958) demostraron que el DNA de E. coli se replica de forma semiconservativa, tal como habían propuesto Watson y Crick (1953) al elaborar el modelo molecular del DNA y tal como podía deducirse de los experimentos realizados previamente por Taylor (1957) sobre la síntesis de DNA en eucariotas. El experimento de Meselson y Stahl está basado en la variación de la densidad de flotación del DNA derivada de la utilización del isótopo pesado del nitrógeno (N15) y el análisis de dicha variación mediante la técnica de Ultracentrifugación en gradiente de Cloruro de Cesio.
El experimento permitió confirmar las teorías de James Watson y de Francis Crick sobre el método de replicación del ADN.


Hicieron crecer cultivos de E. Coli, en un medio con nitrógeno radiactivo N15; después de lavar, se dejó que continuara el crecimiento en un medio normal con N14. El momento adecuado, se añadió el ADN aislado a una solución densa de CsCl.

Meselson y Stahl trabajaron con E. coli y demostraron que su ADN se replicaba por el mecanismo semiconservador propuesto por Watson y Crick:
1) Cultivaron E. coli (varias generaciones) en un medio cuya única fuente de N era NH4Cl marcado con el isótopo pesado N15.

2) Continuaron el cultivo de esas E. coli marcadas con N15 en un medio con N14-NH4Cl normal como única fuente de N (varias generaciones).

3) Extrajeron ADN de las muestras y determinaron la densidad de flotación por centrifugación en gradientes de densidad de CsCl.



El tubo se colocó en una centrifuga, haciéndola funcionar a velocidades suficientemente altas como para producir la sedimentación parcial del CsCl, formándose un gradiente de densidad más denso en el fondo y menos denso arriba. 

En este gradiente, el ADN forma bandas en el nivel donde tiene la misma densidad que la solución salina. Después de una generación de crecimiento en el medio normal el ADN aislado forma una banda que se encuentra a mitad de camino entre el punto de igual densidad para el ADN totalmente marcado con N15 y la posición esperada para el ADN liviano normal (N14).

Después de una generación de crecimiento, entonces, cada molécula de ADN tenía una mitad vieja y una mitad nueva. Calentando el ADN para separar las cadenas y luego recentrifugandolas, se hizo evidente que las moléculas hibridas tenían una cadena de polinucleótidos parental (enteramente con N15) y otra recién sintetizada (completamente con N14). En otras palabras, el ADN se replica en forma semiconservativa.

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